关键词：长春花 细胞悬浮培养 植物生长调节物质 理化因子
一、引言
长春花（Catharanthus roseus(L.) G. Don）属于夹竹桃科（Apocynaceae）长春花属[1]。为多年生草本。原产于非洲东南部，现在我国各地均有栽培。长春花用途广泛，主要含具有抗肿瘤作用的生物碱——长春碱和长春新碱等[2]。长春花组织和细胞培养的研究已经有很多年，多数应用于大量细胞生产和植物的再生，以成分分析、提取为主，应用于次生代谢产物的提取却很少[3]。
长春花的悬浮培养的就是植物细胞工业化的必经步骤和固体培养基相比，细胞悬浮培养具有繁殖速度快、能大规模培养和提供大量均匀一致的植物细胞培养物的特点。然而长春花细胞的悬浮培养技术并不完善，在国内外很少有此类报道。悬浮细胞培养受到许多外界条件的影响。如激素、温度、光照、营养、PH值等。本文就这方面选取了不同的植物生长调节物质种类、浓度组合以及其他的四种理化因子来培养悬浮细胞，以便获得细胞快速增殖的最佳培养条件。
二、材料与方法
1．材料
长春花（Catharanthus roseus(L.) G. Don）取自中科院武汉植物园
2．愈伤组织的诱导
取春天4月份的长春花幼嫩的叶片，为诱导及大量繁殖，必须对外植体进行挑选[4]，用自来水冲洗1-2个小时，滤纸吸干，用75%的酒精侵泡30S后，用0.1%的升汞消毒8min，无菌水冲洗数遍。切成0.5cm×0.5cm 的小块。接种于含0.5mg/L NAA 0.5mg/L 2,4-D 2.0mg/L 6-BA（本文所用的生长调节剂购于上海，配成1mg/mL的母液）、琼脂7g/L、蔗糖30g/L的MS固体培养基上（PH=5.8，高压灭菌）在光强为40ｕmol/ms 12-14h/d.温度为25±2℃条件先诱导[5]。
3．愈伤组织的筛选及细胞悬浮系的建立[6]
诱导出的愈伤组织接种于含50ml固体培养基的150ml的三角瓶中，每瓶的接种量约3g。愈伤组织每25天继代一次。经3-5次继代后，选择生长均一、质地疏松、分散性好的愈伤组织转入液体培养基中。每150ml三角瓶中分装40ml的液体培养基（同上的固体培养基去掉琼脂，以下的实验没有特别说明的都是该种培养基）。每次接种量约为2g。悬浮培养采用旋转式摇床，转速为120r/min。置于光照下培养。
4．细胞干重的测定
细胞悬浮周期为25天。培养结束后，经减压过滤后测其鲜重。然后收集培养物置于60℃烘箱中烘干至恒重称其干重。换算成每天每升培养基增加的细胞干重毫克数，即mg/Ld.表示细胞的生长速度。实验重复三次，取其平均值计算结果。
三、结果与讨论
1．激素组合对长春花细胞悬浮培养生长的效应
（1） 2，4-D和6-BA组合对培养细胞生长的效应
表4 2，4-D和NAA组合对培养细胞生长的效应
2，4-D（0.5） 6-BA x（mg/L）
0.05
0.1
0.2
0.5
1.0
2.0
5.0
干重增加（mg/L）
2352
5008
8200
10109
6095
5832
4000
生长速度（mg/Ld）
95
201
328
405
244
234
160
由表4可以看出，2，4-D和6-BA组合使用比单独一种更有利于细胞的生长。当组合中6-BA在0.05-0.5范围内，细胞生长速度随着浓度的增加而增加。在0.5mg/L2，4-D 0.5mg/L6-BA时，细胞的生长速度最快。而在6-BA在0.5-2.0mg/L时，随着 6-BA的增加，其生长速度不断地下降。
（2）2，4-D、NAA和6-BA组合对培养细胞生长的效应
表5 2，4-D、NAA和6-BA组合对培养细胞生长的效应
2，4-D（0.5） NAA（0.5） 6-BAx（mg/L）
0.05
0.1
0.2
0.5
1.0
2.0
5.0
干重增加（mg/L）
2503
4313
6532
9205
9826